El monasterio ocupa el antiguo palacio donde residieron Carlos I e Isabel de Portugal y donde nació, en 1.535, su hija doña Juana, quien se encuentra sepultada en una capilla, con escultura funeraria orante realizada por Pompeyo Leoni. Fue doña Juana la que fundó en 1.559 este convento de monjas franciscanas descalzas.
El edificio es un característico palacio plateresco castellano, con columnas de mármol de Génova en los patios y salones decorados con azulejos y yeserías de la tradición morisca, pero con formas ya del Renacimiento. En el interior se mantiene la estructura y muchos elementos decorativos del palacio plateresco. Del siglo XVII se conservan pinturas al fresco en la escalera y en la Capilla del Milagro. Destacan los tapices tejidos sobre cartones de Rubens, representando la Apoteosis de la Eucaristía y cuadros de artistas como Tiziano, Sánchez Coello, Brueghel o Luini.
Alberga una excelente colección de pinturas de artistas tan conocidos como Tiziano, Brueghel o Sánchez Coello, no hay que olvidar su colección de tapices e imaginería religiosa. También hay una escalera renacentista decorada con pinturas murales del siglo XVII de una gran belleza. Destacan los tapices, tejidos en Bruselas, sobre cartones de Rubens, que representan la Apoteosis de la Eucaristía.